色谱法是指用于从混合物中分离组分的科学实验室技术。它涉及使溶解在“流动相”中的化合物混合物通过“固定相”,从待混合物中的其他分子中分离和收集待纯化的分析物。该技术涵盖了广泛的多样化应用,包括基础研究,药物发现,法医学,环境测试,运动员药物测试和食品/饮料质量控制。
制备色谱仪操作流程也很重要,下面来讲讲具体的操作:
(1)分析色谱的目的,是分析出混合物中一个(或者几个)纯物质的含量。制备色谱的目的,是从混合物中得到纯物质。
为了加快分离的时间与提高分离的效率,制备色谱的的进样品量很大,导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大,也就必须加大色谱柱填料,增大制备色谱的直径和长度,使用的相对多的流动相。
然而,当色谱柱上样品负载加大的时候,往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱,要解决容量与柱子效果之间的矛盾,对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料,少用溶剂,要尽可能多的得到产品。
(2)样品的前处理:
制备色谱柱子由于处理的样品多,比分析柱子更容易受污染,所以,必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法,如果用得上,而且还不是很麻烦,就要尽可能多的采用以去掉杂质。
(3)固定相的选择
硅胶、键合固定相(如C18)、离子交换树脂、聚酰胺、氧化铝、凝胶等都可以作为色谱柱的填料。有不少文献报道,对填料可以进行一下处理提高了分离效果,如,对硅胶进行的硝酸银(或缓冲液)处理。
(4)装柱方法的选择根据固定相颗粒度和柱子的尺寸,采用不同的装柱方法,往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大,颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说,颗粒直径小于20-30um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击-装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的固定相悬浆以高速装入色谱柱子,从而减少空隙的形成。然而,当柱直径大于20mm,所加压力为30-40bar时,高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱,可采用柱长压缩技术。这种方法,先将固定相悬浆(或偶尔是干填充物)装入柱中加压,利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种:径向压缩和轴向压缩。湿法装柱需要一定的设备,在柱子填完后,应用有柱效的测量,对柱效低的柱子应该重填。
(5)流动相的选择
除了和分析色谱同样的考虑外,在选用流动相时,要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说,不宜采用高毒性溶剂,对多元溶剂要尽可能的少用。
如果产品中含有大量溶剂,溶剂的纯度也要考虑在其中。
(6)加样的方法
可以采用以下方法之一进样。-用注射器进样-用旋转阀进样-通过六通阀进样-通过主泵进样-通过辅泵进样-固体上样
(7)泵的选用
生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的Z大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。
(8)检测器的选用
一般的分析池的Z大允许流速仅为5mL/min或者10mL/min。而专门的制备池的Z大允许流速可为150mL/min。有时,采用旁路分离管,将少量流体导入分析池进行检测,是一个不错的办法,但其浓度的误差会相对较大。
(9)组分保留时间的估计
用分析柱子在同等色谱条件下(同样的固定相和流动相)测定保留时间后,按照单一组分的线流速(不是体积流速)一定,通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。
分析谱图的峰形状,对确定保留时间也有很大的参考价值。
(10)产品的收集
手工馏分收集费时费力,自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。
(11)超载、边缘切割、ZX切割、放大技术与非线性效用
在制备色谱中,因为没有必要达到分析色谱那样的分离度,可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候,也有一些分析色谱的时候,不能用到的技巧。因为篇幅关系,不在这里叙述。
(12)柱转换技术
通过接头或者阀门,实现柱子的简单延长,或者比较方便地实现对其中一个(或几个)组分的精制。